Insights estruturais e mecanísticos sobre fungos β

Nature volume 616, páginas 190–198 (2023) Cite este artigo

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A sintase FKS integrada à membrana está envolvida na biossíntese de β-1,3-glucana, o componente central da parede celular fúngica1,2. A FKS é alvo de antifúngicos amplamente prescritos, incluindo equinocandina e ibrexafungerp3,4. Infelizmente, o mecanismo de ação do FKS permanece enigmático e isso dificultou o desenvolvimento de medicamentos mais eficazes direcionados à enzima. Aqui apresentamos as estruturas de microscopia crioeletrônica de Saccharomyces cerevisiae FKS1 e do mutante resistente à equinocandina FKS1 (S643P). Essas estruturas revelam o sítio ativo da enzima na interface membrana-citoplasma e um caminho de translocação de glucana que abrange a bicamada da membrana. Múltiplos lipídios ligados e notáveis ​​distorções de membrana são observados nas estruturas FKS1, sugerindo interações FKS1-membrana ativas. As mutações resistentes à equinocandina estão agrupadas em uma região perto de TM5-6 e TM8 de FKS1. A estrutura de FKS1(S643P) revela arranjos lipídicos alterados nesta região, sugerindo um mecanismo de resistência a drogas da enzima mutante. As estruturas, o mecanismo catalítico e as percepções moleculares sobre as mutações resistentes a drogas de FKS1 reveladas neste estudo avançam na compreensão mecanicista da biossíntese fúngica de β-1,3-glucano e estabelecem uma base para o desenvolvimento de novos medicamentos antifúngicos visando FKS.

Infecções fúngicas invasivas causam mais de 1,5 milhão de mortes anualmente, representando uma séria ameaça à saúde pública5. Essas infecções são uma preocupação substancial (por exemplo, causando alta mortalidade) para populações imunocomprometidas, bem como para pacientes com COVID-19 (refs. 5,6) (https://www.cdc.gov/fungal/covid-fungal.html ). Classes limitadas de medicamentos antifúngicos e cepas resistentes a medicamentos emergentes, como o recente surto de Candida auris multirresistente, causaram sérios desafios no tratamento de pacientes infectados7,8. Portanto, há uma necessidade premente de desenvolver novos agentes antifúngicos8.

O β-1,3-Glucan é um componente fundamental da parede celular fúngica2, portanto, direcionar sua biossíntese é uma estratégia importante para o desenvolvimento de drogas antifúngicas de amplo espectro3,9. O β-1,3-Glucan da parede celular fúngica é sintetizado pela sintase integrada à membrana FKS10,11, que é regulada pela GTPase Rho1 (refs. 12,13). A FKS transfere a glicose do doador UDP-glicose para a cadeia crescente de glucano por meio de ligações β-1,3-glicosídicas e transloca o β-1,3-glucano polimerizado para o espaço extracelular (Fig. 1a). Ortólogos FKS foram identificados em todos os fungos analisados ​​e são essenciais para a viabilidade de muitos patógenos fúngicos proeminentes. Em Candida glabrata e S. cerevisiae, a interrupção simultânea de FKS1 e FKS2 mostrou fenótipo letal14,15; FKS1 de Candida albicans e Cryptococcus neoformans são essenciais para a viabilidade16,17; o fungo Aspergillus fumigatus com uma deleção FKS1 sofre de graves defeitos de crescimento e lise celular18. Atualmente, existem dois antifúngicos bem conhecidos no mercado que têm como alvo a FKS: a equinocandina, antifúngico de primeira linha amplamente utilizado na prática clínica19, e o ibrexafungerp, um fungicida oral recém-aprovado4. Mais novos agentes direcionados à função FKS (por exemplo, rezafungina) estão entrando em ensaios clínicos em estágio avançado4. Infelizmente, as mutações FKS estão intimamente ligadas à resistência à equinocandina e falha terapêutica, uma preocupação emergente em infecções fúngicas invasivas20,21. Numerosas mutações resistentes à equinocandina identificadas clinicamente estão concentradas em três regiões conservadas de FKS20,22. Mutações em um único alelo FKS são suficientes para tornar as cepas fúngicas resistentes à equinocandina23.

a, Modelo da parede celular fúngica. FKS1 usa UDP-Glc para sintetizar β-1,3-glucana. O gráfico no painel a foi criado usando o BioRender (https://biorender.com). b, Ensaio in vivo de FKS1 examinando o crescimento da cepa WT e da cepa FKS1-KO (KO) com ou sem o inibidor de FKS2 FK506. Os dados são média ± sem; n = 3 experimentos independentes. c, Atividade in vitro de FKS1 purificado por CHAPS com diferentes efetores: UDP-Glc, Rho1, GTPγS e drogas antifúngicas (caspofungina (CFN) e micafungina (MCF)). A atividade foi medida monitorando o UDP gerado. Os dados são média ± sem; n = 3 experimentos independentes. d,e, Digestão enzimática do polímero insolúvel em água sintetizado por FKS1(S643P) purificado por GDN. Foram utilizadas endo-1,3-β-glucanase e endo-1,4-β-glucanase específicas. Estas experiências foram repetidas três vezes com resultados semelhantes. Uma imagem representativa da digestão do polímero (d) e amostras de hidrólise em d retiradas nos momentos indicados e sujeitas a análise por cromatografia em camada fina (e) são mostradas. Glicose (G1), laminaribiose (G2), laminaritriose (G3) e laminarihexaose (G6) foram usados ​​como padrões (pista M). f, análise de ligação glicosil (metilação) do polímero sintetizado por FKS1(S643P) purificado por GDN. Um perfil de cromatograma de gás dos acetatos de alditol parcialmente metilados derivados dos polímeros sintetizados é mostrado. O pico dominante (delineado por uma caixa tracejada verde) representa a ligação 1,3-Glcp, confirmada por espectrometria de massa (Dados Estendidos Fig. 2d). g, Esquema da organização do domínio de FKS1. h, mapa Cryo-EM de FKS1, visto paralelamente à membrana. O mapa é segmentado em quatro partes coloridas em g com densidades semelhantes a lipídios em amarelo claro. i, Duas vistas ortogonais da estrutura FKS1 em exibição de desenho animado. Quatro partes de FKS1 são coloridas como em g. j, Visão intracelular da região citoplasmática com o domínio TM oculto. A folha β central do domínio FKS1 GT é composta de β3–β11 conforme rotulado. As linhas tracejadas indicam regiões desordenadas.