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Nature Communications volume 13, Número do artigo: 4906 (2022) Citar este artigo

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Abordagens de marcação de proximidade baseadas em enzimas baseadas em ésteres ativados ou radicais fenoxi têm sido amplamente utilizadas para mapear proteomas subcelulares e interagentes de proteínas em células vivas. No entanto, os ésteres ativados são pouco reativos, o que leva a um amplo raio de marcação e os radicais fenoxi gerados pelo tratamento com peróxido podem perturbar as vias sensíveis ao redox. Aqui, relatamos um método de rotulagem de proximidade dependente de fotoativação (PDPL) projetado por anexar geneticamente a proteína fotossensibilizadora miniSOG a uma proteína de interesse. Acionado por luz azul e sintonizado pelo tempo de irradiação, o oxigênio singlete é gerado, permitindo assim a marcação de resíduos de histidina por sonda de anilina resolvida no espaço-tempo. Demonstramos sua alta fidelidade por meio do mapeamento de proteomas específicos de organelas. A comparação lado a lado de PDPL com TurboID revela uma cobertura proteômica mais específica e profunda por PDPL. Além disso, aplicamos PDPL ao coativador transcricional relacionado à doença BRD4 e E3 ligase Parkin e descobrimos interagentes anteriormente desconhecidos. Através da triagem de superexpressão, dois substratos não relatados Ssu72 e SNW1 são identificados para Parkin, cujos processos de degradação são mediados pela via ubiquitinação-proteossoma.

A caracterização precisa das redes de proteínas sustenta muitos processos celulares fundamentais1. Assim, o mapeamento espaço-temporal de alta fidelidade das interações proteicas forneceria uma base molecular para decifrar vias biológicas, patologias de doenças, bem como o potencial de perturbar essas interações para fins terapêuticos2. Para este fim, são altamente necessários métodos que possam detectar interações transitórias em células ou tecidos vivos. A espectrometria de massa por purificação de afinidade (AP-MS) foi historicamente usada para reduzir os parceiros de ligação de uma proteína de interesse (POI). Com os avanços nas abordagens de proteômica quantitativa, o maior banco de dados de rede de proteínas Bioplex3.0 baseado em AP-MS foi estabelecido3. Embora o AP-MS seja extremamente poderoso, as etapas de lise celular e diluição no fluxo de trabalho são contra interações de ligação fracas e transitórias e introduzem os artefatos pós-lise, como pares de interação espúria sem compartimentalização antes da lise4.

Na tentativa de enfrentar esses desafios, foram desenvolvidos aminoácidos não naturais (UAA) com grupos de reticulação e plataformas de rotulagem de proximidade enzimática (PL) (por exemplo, APEX e BioID)5. Embora os métodos UAA tenham sido aplicados com sucesso em muitos cenários e forneçam informações sobre ligantes diretos de proteínas6, ainda requerem otimização dos locais de inserção de UAA. Mais importante ainda, é um método de rotulagem estequiométrico sem renovação catalítica do evento de rotulagem. Por outro lado, os métodos PL enzimáticos, como o método BioID, fundem uma ligase de biotina projetada para o POI7, com ativação subsequente da biotina para gerar o éster reativo biotinoil-AMP intermediário. Como tal, a enzima catalisa e libera uma "nuvem" de biotina ativada, que marca resíduos de lisina proximais. No entanto, o BioID requer mais de 12 horas para obter sinal de rotulagem suficiente, o que impede sua aplicação de maneira resolvida temporalmente. Usando a evolução direcionada baseada em exibição de levedura, o TurboID foi projetado a partir do BioID com eficiência muito maior, alcançando rotulagem de biotina eficaz em 10 min8, tornando possível estudar processos mais dinâmicos. Como o TurboID é altamente ativo e os níveis endógenos de biotina são suficientes para rotulagem de baixo nível, a rotulagem de fundo torna-se uma preocupação potencial quando a rotulagem fortemente aprimorada e regulada pelo tempo é necessária por meio da adição de biotina exógena. Além disso, as espécies de éster ativado são pouco reativas (t1/2 ~ 5 min), o que pode levar a um amplo raio de marcação, principalmente após a saturação de proteínas vizinhas com biotina5. Em uma abordagem diferente, uma fusão genética de peroxidase de ácido ascórbico manipulada (ou seja, APEX) gera radicais biotina-fenol após ativação com H2O2 e atinge a marcação de proteínas em um minuto9,10. O APEX tem sido amplamente utilizado na identificação de proteomas subcelulares, complexos de proteínas de membrana e complexos de proteínas de sinalização citosólica11,12. No entanto, a necessidade de altas concentrações de peróxido pode afetar proteínas ou vias sensíveis ao redox, perturbando os processos celulares.

8-fold increase in signal for probe 3, while probe 2 used in the RNA-labeling method CAP-seq only displaying ~2.5-fold signal increase, likely due to different reactivity preferences between RNA and protein (Fig. 1b, c). Furthermore, the isomers of probe 3 and hydrazine probe (probe 5, 6, 7) were also tested, confirming probe 3 as the optimized one (Supplementary Fig. 1b, c). Likewise, in-gel fluorescence analysis determined other optimized experimental parameters: illumination wavelength (460 nm), chemical probe concentration (1 mM), and illumination time (20 min) (Supplementary Fig. 2a–c). Omission of any component or step in the PDPL protocol resulted in significant reversion of signal-to-background (Fig. 1d). Notably, protein labeling was greatly reduced in the presence of sodium azide or trolox, which are known to quench singlet oxygen28. The presence of D2O, known to stabilize singlet oxygen, enhanced the labeling signal. To investigate the contribution of other reactive oxygen species to labeling, mannitol and vitamin C, established hydroxyl radical and superoxide radical scavengers respectively18,29, were added but not found to reduce labeling. The addition of H2O2 rather than illumination failed to generate labeling (Supplementary Fig. 3a). Fluorescent imaging of singlet oxygen by Si-DMA probe confirmed the presence of singlet oxygen in the HEK293T-miniSOG line, but not the parental HEK293T line. In addition, mitoSOX Red was unable to detect superoxide generation after illumination (Fig. 1e and Supplementary Fig. 3b)30. These data strongly indicate singlet oxygen as the major ROS that gives rise to subsequent proteome labeling. The cytotoxicity of PDPL, including the blue light illumination and chemical probe treatment, was evaluated, and no significant cytotoxicity was observed (Supplementary Fig. 4a)./p>2-fold ion intensity difference). Relevant proteins that are significant in HEK293T-miniSOG but not in HEK293T are marked in green. e Specificity analysis for proteomic data sets derived from experiments in d. Total numbers of statistically significant proteins in each organelle (red and green dots) were labeled on top. Bars show organelle-localized proteins based on MitoCarta 3.0, GO analysis, and A. Ting et. al. dataset for mitochondrial, nucleus, and ER, respectively. These experiments were independently repeated at least twice with similar results. Source data are provided as a Source Data file./p>2-fold ion intensity) as well as singleton proteins that are only present in miniSOG-expressing lines (Fig. 3d red and green dots). Combining these data, we identified 1364, 461, and 911 statistically significant proteins for the nucleus, mitochondria, and ER outer membrane, respectively. To analyze the accuracy of organelle-localized PDPL, we used MitoCarta 3.0, Gene ontology (GO) analysis, and the A. Ting et al. dataset8 for mitochondria, nucleus, and ER to validate the organelle-specificity of detected proteins, which corresponded to 73.4, 78.5, and 73.0% accuracy (Fig. 3e). The specificity of PDPL validates that PDPL is an ideal tool for identifying organelle-specific proteomes. Notably, submitochondrial analysis of the identified mitochondrial proteins revealed that the captured proteome was mainly distributed in the matrix and inner membrane (226 and 106, respectively), accounting for 91.7% of the total identified mitochondrial proteins (362), which further confirmed the high-fidelity of PDPL (Supplementary Fig. 7a). Likewise, the subnuclear analysis revealed the captured proteome was predominantly distributed in the nucleus, nucleoplasm, and nucleolus (Supplementary Fig. 7b). Nucleus proteome profiling by nuclear localization signals (3xNLS) peptide revealed similar accuracy to H2B construct (Supplementary Fig. 7c–h). To define the labeling specificity of PDPL, nuclear Lamin A was selected as a more discretely localized POI bait7. PDPL identified 36 significantly enriched proteins, with 12 proteins (30.0%, including Lamin A) being well-characterized Lamin A interacting proteins annotated by the String database, representing a higher percentage than the BioID method (28 out of 122 proteins, 22.9%)7. Our method identified less proteins, likely due to the restricted labeling area, enabled by more reactive singlet oxygen. GO analysis reveals that the identified proteins are mainly located in the nucleoplasm (26), nuclear envelope (10), nuclear membrane (9), and nuclear pore (5). Combined, these nucleus-localized proteins account for 80% of the enriched proteins, further demonstrating the specificity of PDPL (Supplementary Fig. 8a–d)./p>2-fold ion intensity difference). Relevant proteins that are significant in HEK293T-miniSOG but not in HEK293T are marked in green. b Venn diagram showing overlapping proteins between N-terminal and C-terminal constructs. N-terminal tagging can aberrantly activate Parkin and lead to more identified proteins. c Venn diagram showing overlapping proteins between PDPL and AP-MS. Known interactors are listed, including four proteins out of 18 overlapped proteins, as well as 11 proteins out of 159 exclusively identified in PDPL. d Representative targets identified by LC-MS/MS were validated using Western blot. e Ssu72 and SNW1 were identified as unreported substrates of Parkin. Plasmids with these proteins labeled with FLAG were transfected into HEK293T and HEK293T-Parkin-miniSOG, followed by CCCP treatment across different time points. The degradation is more significant in the Parkin overexpressing line. f The Ssu72 and SNW1 degradation process was confirmed to be mediated by the ubiquitination-proteasome pathway by using the proteasome inhibitor MG132. These experiments were independently repeated at least twice with similar results. Source data are provided as a Source Data file./p>

7+ were rejected for MS/MS./p>

7+ were rejected for MS/MS./p>2 (unless otherwise stated) and p value <0.05. Protein interaction analysis was performed using GO analysis as well as the String database./p>