Identificação e caracterização bioquímica de um novo N

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 16991 (2022) Citar este artigo

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A N-acetilglucosamina (GlcNAc) é um componente chave dos glicanos, como a glicoproteína e a parede celular. GlcNAc quinase é uma enzima que transfere um fosfato para GlcNAc para gerar GlcNAc-6-fosfato, que pode ser um precursor para a síntese de glicano. GlcNAc quinases foram encontradas em uma ampla gama de organismos, incluindo leveduras patogênicas, humanos e bactérias. No entanto, esta enzima nunca foi descoberta em Saccharomyces cerevisiae, um modelo eucariótico. Neste estudo, a primeira GlcNAc quinase de S. cerevisiae foi identificada e denominada Ngk1. Os valores de Km de Ngk1 para GlcNAc e glicose foram 0,11 mM e 71 mM, respectivamente, sugerindo que Ngk1 possui uma alta afinidade por GlcNAc, ao contrário das hexoquinases. Ngk1 mostrou a atividade de fosforilação de GlcNAc com vários trifosfatos de nucleosídeos, como ATP, CTP, GTP, ITP e UTP, como doadores de fosforil. Ngk1 é filogeneticamente distante de enzimas conhecidas, pois a identidade da sequência de aminoácidos com outras é de apenas cerca de 20% ou menos. O papel fisiológico de Ngk1 em S. cerevisiae também é discutido.

N-acetilglucosamina (GlcNAc), um carboidrato onipresente em procariotos e eucariotos, é um componente essencial de glicanos como N-glicoproteínas, GPI-âncoras e paredes celulares, incluindo peptidoglicanos de bactérias e quitinas de leveduras1,2,3. Para a biossíntese de glicanos, uridina difosfato N-acetilglicosamina (UDP-GlcNAc) é um substrato essencial tanto em procariotos quanto em eucariotos porque a porção GlcNAc deste açúcar nucleotídeo é incorporada aos glicanos por glicosiltransferases2,3. Geralmente, UDP-GlcNAc é sintetizado a partir de frutose-6-fosfato (Fru-6-P), um intermediário da glicólise, que pode ser convertido em glucosamina-6-P3. Em eucariotos, a glucosamina-6-P é acetilada para ser GlcNAc-6-P, seguida pela isomerização para GlcNAc-1-P3. Em procariotos, por outro lado, a glucosamina-6-P é principalmente isomerizada em glucosamina-1-P e, em seguida, acetilada para ser GlcNAc-1-P3,4. Na etapa final, GlcNAc-1-P é convertido em UDP-GlcNAc por uridilação em procariotos e eucariotos3,4.

GlcNAc quinase (EC 2.7.1.59) é uma enzima metabolizadora de GlcNAc descoberta em amplas espécies de organismos, incluindo bactérias, leveduras patogênicas, plantas e animais3,4,5,6,7,8. Esta enzima transfere o grupo gama-fosforil de um ATP para o grupo hidroxila no C-6 de GlcNAc para gerar um GlcNAc-6-P. A GlcNAc quinase está estruturalmente relacionada à hexoquinase (EC 2.7.1.1), que é outro tipo de açúcar quinase que atua preferencialmente na glicose (Glc) para gerar Glc-6-P na primeira etapa da glicólise, pois essas enzimas comumente possuem uma ATPase domínio9,10. Em mamíferos, GlcNAc quinase é conhecida como uma enzima que fornece uma via de resgate da biossíntese de UDP-GlcNAc, uma vez que esta enzima produz GlcNAc-6-P, que pode ser um precursor de UDP-GlcNAc11. Em contraste, o papel de NagK, a GlcNAc quinase de Escherichia coli, na utilização de GlcNAc para a biossíntese de Fru-6-P foi estudado, uma vez que existe uma via reversa para converter GlcNAc-6-P em Fru-6-P para a fonte de energia na glicólise4. Da mesma forma, CaNag5, a GlcNAc quinase da levedura patogênica Candida albicans, também foi identificada e relatada como envolvida na utilização de GlcNAc para gerar Fru-6-P como fonte de energia3,5,6. Como bactérias, C. albicans pode crescer em GlcNAc como fonte de carbono. De fato, existe uma via para converter GlcNAc em Fru-6-P em C. albicans, porque o agrupamento de genes de enzimas metabolizadoras de GlcNAc, consistindo em GlcNAc quinase (CaNAG5), bem como GlcNAc-6-P desacetilase (CaNAG2) e A glucosamina-6-P desaminase (CaNAG1), foi identificada pela similaridade da sequência com essas enzimas de E. coli4. Foi demonstrado que a interrupção desses genes retardou o crescimento de C. albicans em GlcNAc como fonte de carbono.

Ao contrário de C. albicans, a levedura Saccharomyces cerevisiae não cresce em GlcNAc como fonte de carbono3,5,6. Além disso, qualquer gene semelhante a CaNAG5, CaNAG2 ou CaNAG1 não é conservado em todo o genoma de S. cerevisiae6. Portanto, considerou-se que S. cerevisiae não possui essas enzimas metabolizadoras de GlcNAc. Em S. cerevisiae, a presença de três hexoquinases, Hxk1, Hxk2 e Glk1, é conhecida desde a década de 198012. Acredita-se há várias décadas que S. cerevisiae não possui outra hexoquinase além de Hxk1, Hxk2 e Glk1. No entanto, notamos e focamos a presença de dois outros genes semelhantes à hexoquinase (mas cujas funções eram desconhecidas): EMI2 e YLR446W. Em nosso trabalho anterior, a proteína Emi2 foi identificada como uma quarta nova hexoquinase de S. cerevisiae além das já conhecidas: Hxk1, Hxk2 e Glk113. Neste estudo, nos concentramos em outro gene semelhante à hexoquinase, YLR446W (nome sistemático), que não possui um nome de gene padrão, para examinar se é uma nova hexoquinase adicional neste organismo modelo. Inesperadamente, descobrimos que YLR446W codifica uma nova GlcNAc quinase que mostra baixa similaridade de sequência com GlcNAc quinases conhecidas de outros organismos.